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Nature Microbiology Band 8, Seiten 860–874 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Impfstoffe spielen eine entscheidende Rolle bei der Bekämpfung der COVID-19-Pandemie. Die künftige Bekämpfung der Pandemie erfordert verbesserte Impfstoffe mit hoher Wirksamkeit gegen neu auftretende SARS-CoV-2-Varianten und der Fähigkeit, die Virusübertragung zu reduzieren. Hier vergleichen wir Immunantworten und präklinische Wirksamkeit des mRNA-Impfstoffs BNT162b2, des Adenovirus-Vektor-Spike-Impfstoffs Ad2-Spike und des Lebendimpfstoffkandidaten sCPD9 bei syrischen Hamstern unter Verwendung sowohl homogener als auch heterologer Impfschemata. Die vergleichende Wirksamkeit des Impfstoffs wurde anhand von Daten aus Virustitrationen und Einzelzell-RNA-Sequenzierung bewertet. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die sCPD9-Impfung die stärkste Immunität hervorrief, einschließlich schneller Virusclearance, verringerter Gewebeschädigung, schneller Differenzierung von Präplasmablasten, starken systemischen und mukosalen humoralen Reaktionen und schnellem Abruf von Gedächtnis-T-Zellen aus Lungengewebe nach der Belastung mit heterologem SARS -CoV-2. Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse, dass attenuierte Lebendimpfstoffe Vorteile gegenüber derzeit verfügbaren COVID-19-Impfstoffen bieten.

Im Jahr 2023 erfüllten 13 COVID-19-Impfstoffe die Standards für die Notfallzulassung (EUL) der WHO1. Zu den zugelassenen Impfstoffen gehören inaktivierte Viren und Untereinheiten-Impfstoffe, adenovirale Spike-Impfstoffe und nukleosidmodifizierte mRNA-Impfstoffe2. Während verfügbare Impfstoffe einen langanhaltenden Schutz vor schweren Erkrankungen bieten, ist ein Nachlassen der Immunität offensichtlich, insbesondere nach dem Auftreten und der Verbreitung von Omicron-Varianten3,4.

Optimale COVID-19-Impfstoffe schützen vor schweren Erkrankungen, decken ein breites Spektrum an Virusvarianten ab und verhindern oder begrenzen die Übertragung von SARS-CoV-2. Attenuierte Lebendimpfstoffe (LAV), die erfolgreich gegen Virusinfektionen wie Masern, Mumps und Röteln (MMR)5 eingesetzt werden, bieten Vorteile gegenüber anderen Arten von Impfstoffen. Sie benötigen keine Adjuvantien6 und können lokal verabreicht werden, beispielsweise intranasal, wie im Fall von Influenza-LAVs7. Intranasale LAVs bestehen aus replikationskompetenten Viren und ahmen den natürlichen Verlauf der Infektion und Antigenproduktion nach, was sie von lokal verabreichten, replikationsinkompetenten vektor- oder antigenbasierten Impfstoffen unterscheidet8. Im Gegensatz zu empirisch generierten Impfstoffen, die in der Vergangenheit verwendet wurden, nutzt das moderne LAV-Design molekulare Werkzeuge, um die Virusreplikation und Virulenz zu begrenzen und gleichzeitig die Immunogenität und Antigenintegrität aufrechtzuerhalten9. Eine neuere Strategie beim rationalen Design von LAVs ist die Codon-Paar-Deoptimierung (CPD), die sowohl für DNA-10 als auch für RNA-Viren11, einschließlich SARS-CoV-212, geeignet ist.

Aktuelle COVID-19-Impfstoffe werden intramuskulär verabreicht und induzieren effizient eine systemische Immunität, einschließlich hoher Titer an neutralisierenden Antikörpern, zentralen und Effektor-Gedächtnis-T-Zellen13, nasalen CD8+ T-Zellen14, Keimzentrums-B-Zellen15 und langlebigen Plasmazellen16. Dieser Weg ist jedoch weniger wirksam bei der Auslösung dauerhafter mukosaler IgA- und IgG-Reaktionen17,18 und pulmonaler Gewebe-residenter Gedächtniszellreaktionen19. Schleimhautantikörper an der Eintrittsstelle des Virus spielen eine entscheidende Rolle bei der Begrenzung der Infektiosität und Übertragung20. Dementsprechend unterliegen geweberesidente Gedächtniszellen aufgrund der lokalen Positionierung schnelleren Rückrufreaktionen und ermöglichen eine frühere Erkennung verwandter Antigene21. Daher wird erwartet, dass Impfstoffe, die über die Atemwege verabreicht werden, eine robuste lokale Schleimhautimmunität gegen gezielte Krankheitserreger bieten22. Hier vergleichen wir verschiedene Impfstoffe und Impfschemata und bewerten die systemische und mukosale Immunität, die jeder Impfstoff verleiht.

In einem heterologen SARS-CoV-2-Delta-Challenge-Setting bewerteten wir die Wirksamkeit und Wirkungsweise des kommerziellen mRNA-Impfstoffs BNT162b2 und zweier Impfstoffkandidaten, Ad2-Spike, einem adenoviralen Vektor, der das Spike-Glykoprotein von SARS-CoV-223 trägt, und einem Lebendimpfstoff -abgeschwächtes SARS-CoV-2 mit der Bezeichnung sCPD924,25. Um die Wirksamkeit zu beurteilen, wurden syrische Hamster mit einer Einzeldosis (Prime-Only-Impfung) geimpft und 21 Tage nach der Impfung mit der SARS-CoV-2-Delta-Variante infiziert. Eine andere Gruppe von Hamstern erhielt zwei Impfstoffdosen im Abstand von 21 Tagen (Prime-Boost-Regime) und wurde 14 Tage nach der Auffrischimpfung einer Provokationsinfektion unterzogen (Abb. 1a). Alle Impfungen wurden gut vertragen, was durch eine stetige Gewichtszunahme nach der Impfung belegt wurde (Extended Data Abb. 1a).

a, Experimentelles Schema. Syrische Hamster wurden wie angegeben geimpft und mit SARS-CoV-2 (1 × 105 pfu SARS-CoV-2 Delta) infiziert. Prime- und Prime-Boost-Experimente wurden unabhängig voneinander durchgeführt. b, Körpergewichte (in %) nach der Virusexposition wurden bis zum Analysezeitpunkt gemessen und entsprechend der Impfgruppe angezeigt. Violinplot (abgeschnitten) mit Quartilen und Median. c–l, Ergebnisse von Erstimpfungs- und Provokationstieren (c–e,i,j) und Ergebnisse von Erstimpfungs- und Provokationstieren (f–h,k,l): Anzahl der Kopien der genomischen RNA (gRNA). nachgewiesen in oropharyngealen Abstrichen (c,f) und homogenisiertem Lungengewebe (d,g). e,h, Quantifizierung des replikationskompetenten Virus als pfu pro 50 mg homogenisiertes Lungengewebe. Die gepunktete Linie markiert die Nachweisgrenze (DL = 5 pfu). Titer unterhalb der auf DL/2 = 2,5 pfu i,k festgelegten Nachweisgrenzen. Lungenentzündung wurde einschließlich Schweregrad der Lungenentzündung, Alveolarepithelnekrose und Endothelialitis bewertet. j,l, Lungenödem-Score, der perivaskuläre und alveoläre Ödeme berücksichtigt. m, H&E-gefärbte linke Lungenschnitte veranschaulichen unterschiedliche Schweregrade der Lungenentzündung, einschließlich peribronchialer Manschetten und konsolidierter Bereiche zwischen verschiedenen Impfplänen und nicht geimpften Tieren bei 5 dpc. Maßstabsleiste, 3 mm. In c–e- und f–h-Streupunktdiagrammen: Linien geben Mittelwerte an, Symbole stellen einzelne Hamster dar. In i,j,k,l: Mittellinien stellen Mediane dar, Kästchen das 25. bis 75. Perzentil und Whiskers die Minimal- bis Maximalwerte; Symbole stellen einzelne Hamster dar. In c–l werden die Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) und der Mehrfachvergleichstest nach Tukey gezeigt. n = 5 Tiere pro Gruppe. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 und ****P < 0,0001. Abb. 1a wurde mit BioRender.com erstellt.

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Alle Impfstrategien schützten Hamster vor einem durch eine SARS-CoV-2-Infektion verursachten Körpergewichtsverlust (Abb. 1b). Nach einer einzigen Impfung verhinderte keiner der Impfstoffe eine Infektion durch SARS-CoV-2 Delta vollständig, was durch das Vorhandensein viraler RNA in den Atemwegen belegt wurde (Abb. 1c,d). Nur der sCPD9-Impfstoff reduzierte wirksam das replizierende Virus auf nicht nachweisbare Werte 2 Tage nach der Belastung (dpc) (Abb. 1e). Die Prime-Boost-Impfung verbesserte die Gesamtwirksamkeit des Impfstoffs gegen SARS-CoV-2 (Abb. 1f, g). Nach der Prime-Boost-Impfung war die virale RNA deutlich reduziert, in oropharyngealen Abstrichen und in der Lunge jedoch immer noch in allen Gruppen nachweisbar. Impfschemata mit sCPD9 waren bei der Reduzierung viraler RNA überlegen (Abb. 1f, g). In ähnlicher Weise waren die Konzentrationen des replikationskompetenten Virus in der Lunge bei geimpften Tieren bei 2 dpc signifikant verringert. Wichtig ist, dass nur die sCPD9-Boosterimpfung die replizierenden Viruskonzentrationen unter die Nachweisschwelle senkte, unabhängig von heterologer (mRNA) oder homologer (sCPD9) Grundierung (Abb. 1h). Die Ergebnisse wurden durch Sequenzierung von Massen-RNA aus der Lunge bestätigt (Extended Data, Abb. 1b).

Um infektionsbedingte Lungenschäden festzustellen, wurden infizierte Hamster histopathologisch untersucht. Nach einer Einzelimpfung war sCPD9 am wirksamsten bei der Vorbeugung von Entzündungen und Lungenentzündungen, was durch weniger konsolidierte Lungenbereiche (Abb. 1m) und niedrigere Werte für Lungenentzündung, Bronchitis und Ödeme (Abb. 1i, j und erweiterte Daten Abb. 1c–f) belegt wird ). Bemerkenswerterweise zeigten Tiere, die andere Impfpläne erhielten, eine ausgeprägtere Bronchialhyperplasie (Erweiterte Daten, Abb. 2). Ein ähnlicher Trend wurde bei Prime-Boost-Therapien beobachtet; Insbesondere der mRNA-Impfstoff zeigte jedoch ein verbessertes histologisches Ergebnis aufgrund der homologen Auffrischung (Abb. 1k, l und erweiterte Daten Abb. 1g–j). Insgesamt bot die homologe sCPD9-Prime-Boost-Impfung einen überlegenen Schutz der Lunge vor Entzündungen (Abb. 1m und 2a sowie erweiterte Daten, Abb. 2). Die Analyse des Lungentranskriptoms zeigte auch eine umfassende Herunterregulierung infektions- und entzündungsbedingter Gene bei geimpften Hamstern, wobei die größten Auswirkungen bei homologen und heterologen sCDP9-Impfungen beobachtet wurden (ergänzende Abbildung 1).

a: H&E-gefärbte Lungenschnitte bei 5 dpc aus dem Prime-Boost-Impfexperiment identifizierten perivaskuläre Lymphozyten (1), perivaskuläre Ödeme (2), metaplastische epitheliale Remodellierung (3), Endothelialitis (4) und alveoläre Ödeme (5), wie durch gekennzeichnet nummerierte Pfeile, Gruppen wie angegeben. Maßstabsbalken, 90 µm. b, Zweidimensionale Projektionen von Einzelzell-Transkriptomen unter Verwendung der Uniform Manifold Approximation Projection (UMAP) von Lungenzellen (Prime-Boost-Experiment). Die Zellen werden nach Zelltyp gefärbt, der auf der Grundlage bekannter Markergene annotiert ist. c,d, Manuelle Zellzählung isolierter Lungenzellen pro Lungenlappen (ct-Zellen), berechnete Anzahl der angegebenen Zelltypen (PMN, monozytische Makrophagen) basierend auf scRNA-seq-bestimmten Zellfrequenzen für das Prime-Boost-Experiment (c) und Hauptexperiment (d). Balkendiagramme mit Mittelwert ± Standardabweichung, Symbole stellen einzelne Hamster dar (nsCPD9 = 4, nmRNA = 4, nAd2 = 4, nmock = 4, nsCPD9+sCPD9 = 3, nmRNA+sCPD9 = 3, nmRNA+mRNA = 3, nAd2+Ad2 = 3, nmock+mock = 4), gewöhnliche einfaktorielle ANOVA und Tukey-Mehrfachvergleichstest, **P < 0,01. e, Punktdiagramme, die fache Veränderungen der Genexpression in den angegebenen Zelltypen der vier Prime-Boost-Impfstrategien im Vergleich zu Schein-Schein-geimpften Tieren zeigen. Ausgewählte Interferon-stimulierte Gene und proinflammatorische Zytokine werden wie folgt visualisiert: Färbung und Punktgröße zeigen log2-transformierte Faltungsänderungen (FC) bzw. P-Werte bei geimpften Tieren im Vergleich zu scheingeimpften Tieren an. Die angepassten P-Werte (Padj) wurden von DEseq2 unter Verwendung von Benjamini-Hochberg-Korrekturen der zweiseitigen Wald-Test-P-Werte berechnet. Gene werden durch unbeaufsichtigtes Clustering geordnet. f, Lokalisierung viraler RNA durch In-situ-Hybridisierung in einem Längsschnitt eines Bronchus bei 2 dpc. Rote Signale, virale RNA; Blau, Hämalum-Gegenfärbung. Maßstabsbalken, 30 µm.

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Um das Ausmaß der Entzündung mit zellulären Reaktionen zu korrelieren, führten wir eine Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) von Lungenproben durch (Abb. 2b und ergänzende Abb. 2a). Die Ergebnisse zeigten, dass die pulmonale Rekrutierung monozytischer Makrophagen bei sCPD9 + sCPD9-geimpften Tieren bei 2 dpc signifikant verringert war (Abb. 2c und ergänzende Abb. 2b). Ähnliche, wenn auch weniger ausgeprägte Effekte wurden bei Tieren beobachtet, die nur eine sCPD9-Primärimpfung erhielten (Abb. 2d und ergänzende Abb. 2c). Darüber hinaus waren die durch eine SARS-CoV-2-Infektion26 induzierten Interferon-stimulierten Gene bei geimpften Tieren im Vergleich zu ungeimpften Tieren weitgehend herunterreguliert, wobei monozytische Makrophagen, Treml4+-Monozyten und Endothelzellen besonders ansprechend zu sein schienen (ergänzende Abbildung 3). Entzündungsmediatoren wie Cxcl10 oder Tnfsf10 zeigten im Vergleich zu Interferon-stimulierten Genen ein einheitlicheres Reaktionsmuster über alle Zelltypen hinweg (Abb. 2e und ergänzende Abb. 4a). Da Makrophagen-Subtypen unterschiedliche Genexpressionsmuster zwischen den Impfgruppen zeigten, untersuchten wir die Verteilung der viralen RNA in der Lunge durch In-situ-Hybridisierung (Abb. 2f und ergänzende Abb. 4b). Bei ungeimpften Tieren wurde virale RNA in der gesamten Lunge nachgewiesen, während die mRNA+mRNA-Impfung ihr Auftreten auf einzelne Flecken reduzierte. Bei sCPD9 + sCPD9-Tieren war virale RNA kaum nachweisbar (ergänzende Abbildung 4b). Bemerkenswerterweise war bei mRNA+mRNA-Tieren der größte Teil der nachweisbaren viralen RNA in Makrophagen vorhanden (Abb. 2f).

Um humorale Reaktionen zu bestimmen, quantifizierten wir die Fähigkeit von Hamsterseren, die vor der Belastung (0 dpc) und bei 2 und 5 dpc von mit Prime (Abb. 3a – d) und Prime-Boost (Abb. 3e – h) geimpften Hamstern gesammelt wurden, SARS zu neutralisieren -CoV-2-Varianten. Die Fähigkeit der Seren von sCPD9-Geimpften, die angestammte SARS-CoV-2-Variante B.1 zu neutralisieren, übertraf die aller anderen Gruppen deutlich (Abb. 3a). In ähnlicher Weise sorgten sCPD9-Seren für eine überlegene Neutralisierung der besorgniserregenden Varianten B.1.351 (Beta), B.1.617.2 (Delta) und B.1.1.529 (Omicron, BA.1) (Abb. 3b, c). Bei Omicron BA.1 war die Neutralisationskapazität in allen Gruppen erheblich reduziert; Die Neutralisierung durch sCPD9-Seren war jedoch signifikant (Abb. 3d). Im Allgemeinen erhöhte die Challenge-Infektion die neutralisierenden Antikörper im Laufe der Zeit in allen Gruppen um 5 dpc (Abb. 3a–d).

a–h, Serumneutralisationstiter von Hamstern, die vor (0 dpc) und bei 2 oder 5 dpc mit SARS-CoV-2 eine Prime- (a–d) und Prime-Boost-Impfung (e–h) erhalten haben. Die Neutralisationskapazität wurde gegen Variante B1 (a,e), Beta (b,f), Delta (c,g) und Omicron BA.1 (d,h) getestet. Die untere Nachweisgrenze lag bei einer Verdünnung von 1:8 (gestrichelte Linie) und die obere Grenze bei 1:2.048. Balkendiagramme mit Mittelwert ± Standardabweichung, n = 5 pro Bedingung; in e–h, n = 10 zu Studienbeginn (0 dpc), außer in e und g, wo nsCPD9+sCPD9 (0dpc) = 9 und in h, wo nsCPD9+sCPD9 (0dpc) = 6, nmRNA+sCPD9 (0dpc) = 9 , nmRNA+mRNA (0dpc) = 8, nAd2+Ad2(0dpc) = 8 und nmock+mock (0dpc) = 7 aufgrund begrenzter Serummengen. i, SARS-spezifische IgG-Spiegel gegen Spike, ORF3a und Nukleokapsidprotein in Seren von mit Prime-Boost geimpften Hamstern an den Tagen 0 und 2 nach der Belastung. Die Ergebnisse werden als optische Dichte (OD) angezeigt, bestimmt bei 450 nm. Mittellinie, Median; Kasten, 25. bis 75. Perzentil; Whiskers, minimal bis maximal; Symbole geben einzelne Werte an, nsCPD9+sCPD9 (Tag 0) = 6, nmRNA+sCPD9 (Tag 0) = 6, nmRNA+mRNA (Tag 0) = 7, nAd2+Ad2 (Tag 0) = 8, nmock+mock (Tag 0) = 5, nsCPD9+sCPD9 (Tag 2) = 5, nmRNA+sCPD9 (Tag 2) = 5, nmRNA+mRNA (Tag 2) = 5, nAd2+Ad2 (Tag 2) = 5 und nmock+mock (Tag 2) = 5 Tiere. Für a–i wurden die Mehrfachvergleichstests von Kruskal-Wallis und Dunn durchgeführt; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 und ****P < 0,0001.

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Mit sCPD9 oder dem mRNA-Impfstoff geboosterte Hamster produzierten messbar mehr neutralisierende Antikörper als diejenigen, die nur die Erstimpfung erhielten. Insgesamt erhöhte die Auffrischungsimpfung die Serumneutralisationskapazität bei verschiedenen Varianten (Abb. 3e–h). Unter den getesteten Varianten zeigte Omicron BA.1 die größte Fähigkeit, der Neutralisierung zu entgehen. Nur die Prime-Boost-Impfung mit sCPD9 verlieh Hamstern eine signifikante Fähigkeit, Omicron BA.1 zu neutralisieren (Abb. 3h).

Prime-Boost-sCDP9- und mRNA+sCDP9-geimpfte Hamster zeigten signifikante IgG-Antikörperreaktionen gegen Spike, ORF3a und Nukleokapsidprotein (N), wohingegen IgG von Prime-Boost-mRNA- und Ad2-geimpften Hamstern nur mit Spike-Protein reagierte (Abb. 3i). Obwohl es unwahrscheinlich ist, dass gegen N und ORF3a gerichtete Antikörper zur Virusneutralisierung beitragen, verdeutlicht die Häufigkeit dieser Antikörper die breitere immunologische Reaktion, die durch die LAV-Impfung hervorgerufen wird. Ein höherer Virusneutralisationstiter bei Tieren, die einer Prime-Boost-Impfung unterzogen wurden (vergleiche Abb. 3a–d mit e–h) sowie eine erhöhte IgG-Anti-Spike-Reaktivität nach einer Provokationsinfektion dieser Tiere (ergänzende Abb. 4c) deuten auf einen Vorteil von hin Auffrischungsimpfungen.

Als nächstes bewerteten wir die Immunantwort einzelner Zellen im Blut auf die Prime-Boost-Impfung (Erweiterte Daten, Abb. 3a). Die Blutzellzählung ergab deutlich höhere Zelldichten in sCPD9- und Ad2-geimpften Prime-Boost-Gruppen (Abb. 4a). Sowohl die relative als auch die absolute Zellzahl zeigten erhebliche Unterschiede zwischen den Impfstrategien (Abb. 4b und Extended Data Abb. 3b – d). Die Häufigkeit reifer und unreifer Neutrophiler (imPMN), die insbesondere bei schwerem COVID-1927 und bei SARS-CoV-2-infizierten syrischen Hamstern26 erhöht ist, war bei mit sCPD9 + sCPD9 geimpften Tieren am niedrigsten (Abb. 4b). Im Gegensatz dazu folgten B-, T- und Plasmazellen dem entgegengesetzten Trend und zeigten nach dem sCPD9 + sCPD9-Regime die höchsten Häufigkeiten (Abb. 4b und erweiterte Daten Abb. 3b). In Übereinstimmung mit unseren Beobachtungen in der Lunge waren Gene im Zusammenhang mit Infektionen und Entzündungen in myeloischen Zellen geimpfter Tiere weitgehend herunterreguliert (Abb. 4c und ergänzende Abb. 5).

a–e, Analyse der Zellzusammensetzung und Genexpression durch scRNA-seq bei 2 dpc im Blut von Prime-Boost-geimpften Hamstern. a, Manuelle Zählung der Zellen pro ml Blut. b, Häufigkeiten der angegebenen Zelltypen unter den Blutzellen. Gepunktete Linien markieren die mittleren Werte, die bei naiven Hamstern gefunden wurden (n = 3, Daten zu naiven Hamstern abgeleitet und erneut verarbeitet aus Lit. 26). Balkendiagramme mit Mittelwert ± Standardabweichung, n = 3. Es wurden eine einfaktorielle ANOVA und Tukeys Mehrfachvergleichstest durchgeführt. c, Punktdiagramme, die fache Veränderungen der Genexpression in den angegebenen Zelltypen der vier Prime-Boost-Impfstrategien im Vergleich zu Schein-Schein-geimpften Tieren zeigen. Ausgewählte Interferon-stimulierte Gene und proinflammatorische Zytokine werden wie folgt visualisiert: Färbung und Punktgröße zeigen log2-transformierte FC- bzw. P-Werte bei geimpften Tieren im Vergleich zu scheingeimpften Tieren an. Padj wurden von DEseq2 unter Verwendung von Benjamini-Hochberg-Korrekturen zweiseitiger Wald-Test-P-Werte berechnet. Gene werden durch unbeaufsichtigtes Clustering geordnet. d, Punktdiagramme, die die Expression ausgewählter B-Zell-Entwicklungsmarkergene in den in der ergänzenden Abbildung 9a gezeigten Blut-B-Zell-Subclustern zeigen. Die Größe des Punkts stellt den Anteil der Zellen dar, in denen mindestens ein eindeutiger molekularer Identifikator (UMI) des jeweiligen Gens nachgewiesen wurde, während die Farbe proportional zur durchschnittlichen Expression in diesen Zellen ist. e, Häufigkeiten und Anzahlen von Präplasmablasten (Prä-PB), die im B-Zellcluster 3 identifiziert wurden, und Speicher-zu-Präplasmablasten-Übergangszellen (mem->Prä-PB), die im B-Zellcluster 6 identifiziert wurden. Balkendiagramme mit Mittelwert ± sem, n = 3. Es wurden einfaktorielle ANOVA und Tukey-Mehrfachvergleichstests durchgeführt; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

Quelldaten

Um die Aktivierung des impfstoffinduzierten Immungedächtnisses zu untersuchen, untersuchten wir zunächst Einzelzelltranskriptome zirkulierender B-Zellen, wobei der Schwerpunkt auf B- und Plasmazellen von mit Prime-Boost geimpften Hamstern lag. Die Subclusterung ergab 8 Populationen (ergänzende Abbildung 6a), die auf der Grundlage bekannter Markergene 28, 29 zellulären Zuständen zugeordnet wurden. Bemerkenswert ist, dass diese Zuordnungen mangels Informationen zu Oberflächenmarkierungen wahrscheinlich unvollständig bleiben. In unserer Analyse haben wir uns daher auf Unterschiede in den Genexpressionsmustern konzentriert und untersucht, ob eine mutmaßliche „Memory-Recall-Genexpressionssignatur“ Unterschiede aufweisen würde. Wir haben zunächst festgestellt, dass Cluster 8 aufgrund der Anwesenheit von beispielsweise Prdm1 (das Blimp-1 kodiert) oder Irf4 wahrscheinlich Plasmablasten/Plasmazellen darstellt. Cluster 3 wies mittlere Prdm1-Level sowie Tnfrsf17 und Tnfrsf13b auf. Cluster 6 zeigte im Vergleich höhere Werte von Pax5, Cd19, Cd27, Bach2 oder Aicda und niedrigere Werte von Prdm1, Xbp1 oder Spib (ergänzende Abbildung 6b). Auf der Grundlage dieser Muster gingen wir davon aus, dass diese beiden Cluster (Prä-)Plasmablasten enthalten würden und daher für die Untersuchung des Gedächtnisabrufs am interessantesten wären. Bei der Untersuchung einer Reihe von Genen, die an der B-Zell-Regulation beteiligt sind, fanden wir eine Hochregulierung von Irf4, Pax5 und Tnfrsf13b/c in Cluster 3, während in Cluster 6 Bach2, Irf4, Pax5 und Tnfrsf13b/c sowie Aicda, Batf und Cd27 hochreguliert waren herunterreguliert (Abb. 4d und ergänzende Abb. 6c). Diese potenzielle frühe „Memory-Recall-Genexpressionssignatur“ war bei homologer oder heterologer Prime-Boost-Impfung mit sCPD9 am stärksten, was den höchsten Antikörpertiter induzierte (Abb. 3e – h). Dementsprechend waren die Zellen der Cluster 3 und 6 bei mit sCPD9 + sCPD9 geimpften Hamstern deutlich häufiger anzutreffen (Abb. 4e).

Um das Auftreten des T-Zell-Gedächtnisabrufs zu untersuchen, fuhren wir mit der Subclusterung von T- und natürlichen Killerzellen (NK) fort. Zu diesem Zweck haben wir CD4+, CD8+ und proliferierende T-Zellen im Blut untersucht (Abb. 5a, b und ergänzende Abb. 7 und 8). Analysen der Genexpression, die auf Proliferation (Mki67, Top2a), naiven oder zentralen Gedächtnisstatus (Sell, Ccr7, Lef1, Il7r) und Aktivierung von T-Zellen (Cd69, Cd44, Klrg1, Icos, Cd40lg) hinweisen, ergaben, dass die meisten Blut-T-Zellen angezeigt wurden entweder naive oder zentrale Gedächtnisphänotypen (Cluster 0–4, ergänzende Abb. 7b – e). Bei 2 dpc wurden Typ-1-Immuneffektorgene (Tbx21, Gzma, Gzmb, Faslg, Ifn) nur von Blut-NK-Zellen exprimiert (Cluster 5, ergänzende Abbildung 8). Die proliferierende T-Zellpopulation bestand aus aktivierten T-Zellen, die Gedächtnismarker wie Il7r exprimierten (Cluster 6, ergänzende Abbildung 8). Proliferierende T-Zellen waren nach heterologer Impfung signifikant erhöht, wenn auch im Allgemeinen in geringer Zahl (Abb. 5b). Dementsprechend waren der Zellanteil und das Expressionsniveau proliferationsassoziierter Gene am höchsten, wenn sCPD9 in das Impfschema einbezogen wurde (Abb. 5c). Um die T-Zell-Antigenspezifität zu bestimmen, haben wir Hamster entweder mit sCDP9 oder mRNA geimpft und ihre Splenozyten 14 Tage später mit rekombinantem SARS-CoV-2 S- oder N-Protein stimuliert. Als Anzeige diente der Enzyme-linked Immunosorbent Spot (ELISpot) mit Interferon-Gamma (IFN-γ). Die Spike-Protein-Stimulation induzierte bei beiden Impfstoffen die IFN-γ-sekretierende Zellen, während bei der Stimulation mit N-Protein nur Splenozyten aus sCPD9-Impfstoffen signifikant mehr IFN-γ als Scheinimpfstoffe sezernierten, was eine überlegene und breitere T-Zell-Immunität bei der LAV-Impfung offenbarte (Abb. 5d). ).

a–k, T-Zell-Untergruppen durch scRNA-seq (2 dpc) von Prime-Boost-geimpften Hamstern. Häufigkeit und Anzahl von (a) CD4- (Cluster 0,1,2) und CD8-T-Zellen (Cluster 3,4) und (b) proliferierenden T-Zellen (Cluster 6) im Blut. Balkendiagramm mit Mittelwert ± Standardabweichung, n = 3 für alle Gruppen, außer nmock+mock = 4. Gewöhnliche einfaktorielle ANOVA und Tukey-Mehrfachvergleichstest. c, Punktdiagramme, die die Expression ausgewählter Gene im Blutcluster 6 zeigen (T- und NK-Subcluster-Analyse in ergänzender Abbildung 7a). Die Punktgröße stellt den Anteil der Zellen mit UMI > 1 dar, die Farbe zeigt den Ausdruck an. d, IFN-γ ELISpot-Analyse 14 Tage nach der Erstimpfung. Balkendiagramm mit Mittelwert ± SEM, n = 6, das die auf mittlere Stimulation normalisierten Spotzahlen für jedes Tier einzeln anzeigt. Gepunktete Linie, obere Nachweisgrenze (ULD). Zweifaktorielle ANOVA und Tukey-Mehrfachvergleichstest. z. B. Häufigkeiten und Anzahlen von (e) geweberesidenten Gedächtnis-T-Zellen (Trm, Cluster 6), (f) aktivierten T-Zellen (Act T, Cluster 2) und (g) proliferierenden T-Zellen (prolif T-Zellen, Cluster). 5 + 8) in der Lunge. Gewöhnliche einfaktorielle ANOVA und Tukey-Mehrfachvergleichstest. Balkendiagramm mit Mittelwert ± Standardabweichung, n = 3 für alle Gruppen, außer nmock+mock = 4. In a,b,d–g: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ** **P < 0,0001. h, Punktdiagramme, die die Expression ausgewählter Gene in der Lunge, Cluster 5 und 8, zeigen (T- und NK-Subcluster-Analyse in ergänzender Abbildung 9a). Die Punktgröße stellt den Anteil der Zellen mit UMI > 1 dar, die Farbe zeigt den Ausdruck an. i,j, Signatur-Score des Trm-Gensatzes (Ref. 28,31) in Zellen ausgewählter T-Zell-Subcluster über alle Gruppen (i) und für einzelne Gruppen (j), die Farbe zeigt den Signatur-Score für den Trm-Gensatz an. k, Trm-Signatur-Score in Zellen von Cluster 5. Mitte, Median; Kasten, 25. bis 75. Perzentil; und Whiskers, minimale bis maximale Werte. Kreise zeigen einzelne analysierte Zellen in Cluster 5 an, gepoolt aus n = 3 für alle Gruppen, außer nmock+mock = 4 Tiere. l, PAGA. Knoten stellen Cluster dar, Kanten stellen das Ausmaß der Clusterverbindung dar, die Knotengröße entspricht der Clusterzellenzahl und die Liniendicke ist proportional zur Konnektivität. m, Trm-Signatur-Score (Ref. 28,31) als Funktion des Diffusions-Pseudozeitrangs, wobei die schwarze Linie eine Polynomanpassung dritten Grades zeigt.

Quelldaten

Als nächstes untersuchten wir, ob sich verschiedene Prime-Boost-Impfstrategien in der Fähigkeit unterscheiden, geweberesidente Gedächtnis-T-Zellen (Trm) in der Lunge zu reaktivieren30. Um pulmonale T-Zell-Untergruppen zu charakterisieren, haben wir die anfänglichen T- und NK-Zell-Cluster in 10 Subcluster unterteilt (ergänzende Abbildung 9a). Auf der Grundlage der Nkg7-, Cd3e-, Cd4- und Cd8a-Genexpression ordneten wir die Cluster 3, 7 und 9 als NK-Zellen, Cluster 4 als CD8+ T-Zellen, die Cluster 0, 1, 2 und 6 als CD4+ T-Zellen und die Cluster 8 und zu 5 als proliferierende T-Zellen (Mki67, Top2a) (Ergänzende Abb. 9b, c). Unter den CD4 + T-Zellclustern zeigten die Zellen in Cluster 2 einen gemischten Phänotyp aus Effektor-, Aktivierungs- und Gedächtnisgenmarkern (ergänzende Abbildungen 9b – e und 10a, b), und die Zellen in den Clustern 0 und 1 waren vom naiven oder zentralen Gedächtnistyp (Sell, Ccr7, Lef1, Il7r, Tcf7, S1pr1) (Ergänzende Abbildung 10a). In Cluster 6 fanden wir keine Gene, die mit naiven oder zentralen gedächtnisassoziierten Signaturen assoziiert sind (ergänzende Abbildung 10a), sondern eine kombinierte und starke Expression von T-Zell-Homing- und Geweberetentionsgenen (Cxcr6, Rgs1, Prdm1, Znf683, Itga1 und). Itgae), eine Signatur, die den Trm-Status anzeigt (Ergänzende Abbildungen 10b, c und 11). Trm-Zellen (Cluster 6) zeigten in sCPD9-geimpften Gruppen ein höheres Genexpressionsniveau und eine höhere Zellfraktion, die Cxcr6, einen prominenten Gewebe-Homing-Rezeptor, exprimierte, während der Lymphknotenretentionsrezeptor S1pr1 am wenigsten nachgewiesen wurde (ergänzende Abbildung 12a). Bei aktivierten T-Zellen (Cluster 2) war die Genexpression von Aktivierungs- und Effektorgenen unabhängig von der vorherigen Impfung (ergänzende Abbildung 12a). Bei 2 dpc waren die Trm-Zellen sowie die aktivierten und proliferierenden T-Zellpopulationen klein und machten weniger als 2 % aller Lungenzellen aus. Trm-Zellen und aktivierte T-Zellen tendierten bei infizierten sCPD9-Impflingen zu höheren Häufigkeiten und Zahlen, doch nur proliferierende T-Zellen zeigten signifikant höhere Werte (Abb. 5e–g). Bemerkenswert ist, dass ihre Gegenstücke in der Lunge im Gegensatz zu proliferierenden T-Zellen im Blut höhere Mengen an Ifng und Gzma exprimierten (Abb. 5h).

Als nächstes bewerteten wir die Seurat-Cluster für einen veröffentlichten menschlichen Trm-Gensatz31 und beobachteten eine Untergruppe von Zellen in Cluster 5 (proliferierende T-Zellen) mit einem hohen Trm-Signatur-Score (Abb. 5i). Bei 2 dpc war der Trm-Signatur-Score in proliferierenden T-Zellen (Cluster 5) bei sCPD9-Impflingen deutlich höher (Abb. 5j, k). In Cluster 8 (proliferierende T-Zellen) waren die Gesamtzellzahlen zu niedrig, um interpretierbare Ergebnisse zu erzielen, und es wurden keine Zellen von ungeimpften Tieren identifiziert (ergänzende Abbildung 12b). Mithilfe eines Partition-based Graph Abstraction (PAGA)-Ansatzes32 identifizierten wir eine besonders starke Konnektivität zwischen den Clustern 2, 8 und 5 und den Clustern 2 und 6 sowie eine mögliche Verbindung zwischen den Clustern 6 und 8 (Abb. 5l). Das Ordnen von Zellen nach globaler Expressionsähnlichkeit durch Diffusionspseudozeit und das Auftragen dieses Rangs gegen die Trm-Signatur bestätigt weiter einen Pfad zwischen den Clustern 2 und 6 und den Clustern 8 und 5, der mit einer variablen Trm-ähnlichen Genexpression einhergeht (Abb. 5m und Ergänzung). Abb. 12c,d). Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass eine Untergruppe proliferierender T-Zellen aus dem Trm-Recall stammt und als Reaktion auf eine SARS-CoV-2-Challenge-Infektion bei sCPD9-verstärkten Hamstern aktiviert wird.

Neben einem starken T-Zell-Gedächtnis und einer humoralen Immunität ist die Induktion einer schützenden Schleimhautimmunität eine charakteristische Eigenschaft von LAVs, die an den Eintrittsstellen des Virus verabreicht werden34. Um die Induktion der Schleimhautimmunität mit Impfschemata zu korrelieren, haben wir die SARS-CoV-2-Spike-spezifischen IgA-Spiegel und die Neutralisationskapazität von Nasenspülungen gemessen. Wir fanden heraus, dass Tiere, die nur mit sCPD9 geimpft wurden, deutlich größere Mengen an IgA in Nasenspülungen vor und nach der Belastung aufwiesen (Abb. 6a). Die Challenge-Infektion steigerte die Konzentration von SARS-CoV-2-Spike-spezifischen IgA-Antikörpern bei sCPD9-geimpften Tieren weiter und induzierte nachweisbare Mengen bei mRNA- und Ad2-geimpften Tieren. Mikroneutralisationstests gegen SARS-CoV-2 (Variante B.1) mit Nasenspülungen von mit Prime geboosterten Tieren bestätigten die IgA-Messungen. sCPD9-Impflinge zeigten deutlich höhere Neutralisationskapazitäten bei 2 und 5 dpc (Abb. 6b). Dementsprechend identifizierten wir IgA-positive Lymphozyten in der Nasenschleimhaut geimpfter Tiere (Abb. 6c). Die histopathologische Bewertung zeigte, dass mit sCPD9 geimpfte Tiere weniger betroffene Gewebebereiche, weniger Schäden und eine geringere Rekrutierung von Immunzellen aufwiesen (Abb. 6d, e und erweiterte Daten Abb. 4a). Die sCDP9-Impfung reduzierte die virale RNA in Nasenspülungen im Vergleich zur Scheinimpfung bei 2 dpc signifikant (Abb. 6f), was mit einem verringerten Signal in der immunhistochemischen Färbung für virales N-Protein korreliert (Abb. 6d). Um die mutmaßlich positiven Auswirkungen der Schleimhautimmunität weiter zu bewerten, griffen wir auf scRNA-seq von Nasengewebezellen zurück. Zunächst haben wir die Zelltypen anhand zuvor veröffentlichter Markergene annotiert (Extended Data Abb. 4b35). Insbesondere in neuronalen Zellen zeigte die Analyse der differentiellen Genexpression, dass Interferon-stimulierte Gene (Isg15, Oasl2 oder Rsad2) bei sCPD9-Impflingen weniger exprimiert wurden (Abb. 6g und ergänzende Abb. 13). Bemerkenswert ist, dass Reaktionen neuronaler Zellen im Riechepithel durch Zuschauer mit dem Verlust des Geruchssinns nach einer SARS-CoV-2-Infektion verbunden sind36. Darüber hinaus finden wir Hinweise darauf, dass die LAV-Impfung die Übertragung von SARS-CoV-2 verhindert. Nach einer Provokationsinfektion schieden LAV-geimpfte Tiere deutlich geringere Virusmengen aus als mRNA-geimpfte Tiere. In diesem Aufbau konnte die LAV-Impfung die Übertragung von SARS-CoV-2 verhindern, während dies bei der mRNA-Impfung nicht der Fall war (Extended Data Abb. 5). Zusammengenommen liefern wir Beweise dafür, dass das sCPD9-LAV sowohl in den unteren als auch in den oberen Atemwegen einen überlegenen Schutz gegen SARS-CoV-2 bietet, was es zu einem vielversprechenden Kandidaten für weitere Untersuchungen in klinischen Studien macht.

a, ELISA zum Nachweis von Anti-Spike-IgA-Spiegeln in Nasenspülungen von erstgeimpften Hamstern zu angegebenen Zeitpunkten nach der Belastung (dpc). Ergebnisse zeigen OD450 an. b, Neutralisierungskapazität gegenüber B.1 von Nasenspülflüssigkeiten von erstimpfungsgeimpften Hamstern zu angegebenen Zeitpunkten. Balkendiagramme zeigen den Mittelwert ± sd Kruskal-Wallis und Dunns Mehrfachvergleichstest pro Zeitpunkt; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Symbole kennzeichnen einzelne Hamster, n = 5 Tiere pro Gruppe. c, Immunhistochemische Färbung von IgA im Riechepithel und in den Submukosadrüsen bei 2 dpc. Maßstabsbalken, 60 µm. d: Histopathologische Längsschnitte des Riechepithels mit H&E-Färbung (links) und SARS-CoV-2-N-Protein-Immunhistochemie (rechts) des Prime-Only-Experiments bei 2 dpc, mit einem zusätzlichen Abschnitt eines nicht infizierten Gewebes. e, Wie in d, jedoch für das Prime-Boost-Impfexperiment. Maßstabsbalken, 20 µm. In c–e sind die Bilder repräsentativ für n = 5 Hamster pro angegebener Gruppe. Prime- und Prime-Boost-Experimente wurden unabhängig voneinander durchgeführt. f, Virus-RNA-Lasten, nachgewiesen in Nasenspülungen erstgeimpfter Hamster bei 2 und 5 dpc. In Streupunktdiagrammen geben Linien Mittelwerte an, Symbole stellen einzelne Hamster dar. n = 5. Zweifaktorielle ANOVA und Tukey-Mehrfachvergleichstest; *P < 0,05. g, Punktdiagramme, die fache Veränderungen der Genexpression in den angegebenen Zelltypen der drei Hauptimpfstrategien im Vergleich zu scheingeimpften Tieren zeigen. Ausgewählte Interferon-stimulierte Gene und proinflammatorische Zytokine werden wie folgt visualisiert: Färbung und Punktgröße zeigen log2-transformierte FC- bzw. P-Werte bei geimpften Tieren im Vergleich zu scheingeimpften Tieren an. Padj wurden von DEseq2 unter Verwendung von Benjamini-Hochberg-Korrekturen zweiseitiger Wald-Test-P-Werte berechnet. Gene werden durch unbeaufsichtigtes Clustering geordnet.

Quelldaten

Aktuelle COVID-19-Impfstoffe sind hochwirksam bei der Vorbeugung schwerer Erkrankungen; Allerdings wird eine Infektion mit neu auftretenden Varianten nicht verhindert und die Viruslast kann bei geimpften Personen hoch sein37. Um die Virusübertragung zu kontrollieren und symptomatische Infektionen zu begrenzen, wird davon ausgegangen, dass die Schleimhautimmunität an der Eintrittsstelle des Virus von größter Bedeutung ist38,39,40.

Wir stellen hier einen plattformübergreifenden Impfstoffvergleich vor, der einen LAV umfasst, der unserer Meinung nach einen überlegenen Schutz vor einer SARS-CoV-2-Infektion hervorruft, insbesondere an Schleimhauteintrittsstellen des Virus. Dies steht im Einklang mit früheren präklinischen COVID-19-Impfstoffstudien, bei denen die intranasale Verabreichung von LAV, proteinbasierten oder virusvektorisierten Spike-Impfstoffen24 und eine effiziente Induktion der Schleimhautimmunität41,42,43,44 zum Einsatz kamen. Unsere Beobachtungen zu einer verbesserten Immunität, die durch heterologe Prime-Boost-Impfung induziert wird, stimmen mit aktuellen Studien überein, die systemisches Priming gefolgt von einem intranasalen Boost mit Adenovirus-Vektor- oder mRNA-Impfstoffen kombinieren19,45. Wichtig ist, dass virusneutralisierende Anti-SARS-CoV-2-IgA in der Nasenschleimhaut geimpfter Tiere bei sCPD9-geimpften Tieren viel höher sind. Es ist bekannt, dass Schleimhaut-IgA verschiedene Funktionen ausübt, wie z. B. die Blockierung des Viruseintritts, die Verhinderung der intrazellulären Fusion von Viren und endosomalen Membranen sowie die Hemmung der Freisetzung von Viren aus Wirtszellen46. Der allgemeine Schutz vor Virusreplikation, Gewebeschäden und Lungenentzündung war bei mit sCPD9 geimpften Tieren deutlich besser. Gleichzeitig war die Antigenerkennung bei Tieren, die sCPD9 erhalten hatten, erheblich umfassender, und diese Vorteile sind wahrscheinlich auf wichtige charakteristische Merkmale von LAV zurückzuführen. Dazu gehören die Verabreichung über den natürlichen Infektionsweg, die Präsentation des gesamten Antigenrepertoires des Virus und die Replikation, die den Zielpathogen nachahmt. Darüber hinaus kann die aktive Replikation von LAVs im Vergleich zu nicht replizierenden Impfstoffen zu einer längeren und verstärkten Präsentation viraler Antigene führen – ein Faktor, der zu der hier beobachteten besseren Wirksamkeit beitragen könnte. In einem kleinen Experiment konnte die LAV-Impfung die Weiterübertragung von SARS-CoV-2 verhindern, während die mRNA-Impfung nur geringe Auswirkungen auf die Übertragung hatte. Die scRNA-seq-Analyse von Blut-, Lungen- und Nasenschleimhautproben von geimpften und mit SARS-CoV-2 infizierten Hamstern ergab, dass bei allen wichtigen Parametern die Auswirkungen der sCPD9-Impfung in einer Prime-Only-Umgebung am stärksten waren. In ähnlicher Weise war in einer Prime-Boost-Umgebung die doppelte sCPD9-Impfung der mRNA-sCPD9-Impfung überlegen, gefolgt von der doppelten mRNA-Impfung und der doppelten Adenovirus-Impfung. Mit sCPD9 geimpfte Tiere hatten eine deutlich verringerte Induktion entzündungsfördernder Genexpressionsprogramme – ein Hauptmerkmal der COVID-19-Pathogenese47. Dies traf insbesondere auf Zellen des angeborenen Immunsystems wie Monozyten und Makrophagen zu, die bei der Aufnahme von SARS-CoV-2 typischerweise starke proinflammatorische Transkriptionsreaktionen zeigen26. Auf den Menschen übertragbar könnte dies auch bei einer Infektion mit heterologen SARS-CoV-2-Varianten eine deutlich höhere Wahrscheinlichkeit für einen milden oder asymptomatischen Krankheitsverlauf bedeuten.

Darüber hinaus haben wir mehrere Genexpressionssignaturen entdeckt, die mit der Aktivierung des adaptiven Immungedächtnisses zusammenhängen. Die verstärkte Entwicklung hin zu Präplasmablasten, die aus Gedächtnis-B-Zellen stammen, und die verstärkte T-Zell-Proliferation im Blut von infizierten Tieren durch scRNA-seq deuten auf eine schnelle Aktivierung von Gedächtniszellen hin48. Wir haben auch eine signifikant erhöhte Anzahl proliferierender T-Zellen in der Lunge von Hamstern festgestellt, die sCPD9 erhalten hatten. Eine Untergruppe dieser proliferierenden T-Zellen teilte eine Trm-spezifische Signatur und zeigte Konnektivität zum identifizierten Trm-Cluster. Eine mögliche Erklärung für diese Beobachtung ist, dass die Aussaat von SARS-CoV-2-spezifischen geweberesidenten Gedächtnis-T-Zellen nach der sCPD9-Impfung verstärkt wird, was möglicherweise schnellere lokale Erinnerungsreaktionen ermöglicht, die durch eine verstärkte Proliferation von T-Zellen in entsprechenden Impfstoffgruppen gekennzeichnet sind. LAVs ahmen eine natürliche Infektion nach, die bekanntermaßen SARS-CoV-2-spezifische CD4+ Th1-Zellen induziert, die IFN-γ49 sezernieren. Wir entdeckten eine IFN-γ-Hochregulation in proliferierenden pulmonalen T-Zellen, was darauf hindeutet, dass die SARS-CoV-2-Exposition eine Th1-Effektorzelltyp-Reaktion auslöste, und die IFN-γ-ELISpot-Analyse zeigte eine Multiantigen-Reaktivität in Splenozyten von LAV-geimpften Hamstern. Während die mukosale IgA-Induktion nach wie vor am wichtigsten für die Begrenzung der Infektion und damit der Übertragung ist, tragen CD4+-T-Zellen mit Atemwegsgedächtnis zum Schutz vor anderen Coronaviren bei30 und verbessern möglicherweise das Antigenrepertoire, das in einem mukosalen SARS-CoV-2-Impfstoff erkannt wird. In ähnlicher Weise zeigten frühere Studien mit Ovalbumin-Antigenen und einer Kombination verschiedener Impfwege, dass nicht nur IgA, sondern auch die allgemeine Th1-vermittelte Immunität durch die Verabreichung über die Schleimhaut verstärkt wird50.

Unsere Einzelzell-RNA-Sequenzierungsanalyse weist mehrere Einschränkungen auf. Diese Technik, wie sie hier verwendet wird, kann Prozesse wie die Reaktivierung von Gedächtniszellen aufgrund fehlender Oberflächenmarker und zelltypspezifischer Anreicherung nicht vollständig erfassen. Aufgrund der unvollständigen Annotation des Genoms des Syrischen Hamsters konnten wir keine IgA-positiven Zellen identifizieren. Die Datenqualität der Nasenschleimhautzellen war aufgrund der schwierigen Dissoziation des Gewebes vergleichsweise gering, was unsere Beobachtungen am Ort der Erstinfektion einschränkte. Die von uns vorgelegten Daten zur Auswirkung der Impfung auf die Übertragung des Challenge-Virus sind vorläufig und erfordern umfangreichere Studien, die Verwendung neuerer SARS-CoV-2-Varianten und mechanistische Analysen zur Validierung. Während unsere Daten Überlegenheit zeigen und daher eine Weiterentwicklung und Verfeinerung von LAVs versprechen, gibt es einen Vorbehalt bei der Extrapolation der Ergebnisse präklinischer Tierversuche auf die Situation beim Menschen. Es ist klar, dass klinische Studien zur Sicherheit und Wirksamkeit abgeschwächter Lebendimpfstoffe erforderlich sind, um das Potenzial dieser Impfstoffe zur Bekämpfung der noch andauernden Pandemie realistisch einzuschätzen.

Ein Problem bei LAVs ist ihre potenzielle Anfälligkeit für eine bereits etablierte Immunität51, was die Replikation des Impfvirus einschränken und möglicherweise ihre Verwendung als Auffrischimpfung nach einer Erstimmunisierung durch Impfung oder natürliche Infektion einschränken würde. Wir zeigen hier, dass sCPD9 die Immunantwort wirksam steigert und den Schutz erheblich verbessert, wenn es drei Wochen nach der ersten Impfung angewendet wird. Wichtig ist, dass sCPD9 humorale Immunantworten verstärkt, insbesondere gegen bekannte Immun-Escape-Varianten wie Beta und Omicron BA.1, und gleichzeitig das virologische Ergebnis einer heterologen Challenge-Infektion verbessert, wenn es drei Wochen nach der ersten Impfung als Booster verabreicht wird. Dies weist auf ein breites Anwendungsspektrum von LAVs in Populationen hin, die einen hohen Grad an Grundimmunität aufweisen, die durch eine frühere Impfung oder Infektion hervorgerufen wurde.

Aufgrund seines hohen Sicherheitsprofils wurde sCPD9 kürzlich von der zuständigen deutschen Landesbehörde von der Biosicherheitsstufe (BSL) 3 auf BSL 2 herabgestuft52. Dies ist ein wichtiger Schritt hin zur klinischen Anwendung eines SARS-CoV-2-LAV, da es die Produktion eines Impfstoffs in klinischer Qualität erleichtern und klinische Studien am Menschen erheblich erleichtern wird.

In-vitro- und Tierversuche wurden unter geeigneten Biosicherheitsbedingungen in einer BSL-3-Einrichtung am Institut für Virologie der Freien Universität Berlin, Deutschland, durchgeführt. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für die Pflege und den humanen Umgang mit Tieren durchgeführt und von der zuständigen Landesbehörde, dem Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin, Deutschland (Genehmigungsnummer 0086/20), genehmigt.

Vero E6 (erhalten von ATCC, CRL-1586), Vero E6-TMPRSS2 (erhalten vom National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC), 100978) und Calu-3 (erhalten von ATCC, HTB-55) wurden in kultiviert Minimal Essential Medium (MEM) mit 10 % fötalem Rinderserum, 100 IU ml−1 Penicillin G und 100 µg ml−1 Streptomycin bei 37 °C und 5 % CO2. Darüber hinaus enthielt das Zellkulturmedium für Vero E6-TMPRSS2-Zellen 1.000 µg ml−1 Geneticin (G418), um die Selektion auf Zellen sicherzustellen, die die Gene für Neomycinresistenz und TMPRSS2 exprimieren.

Die modifizierte lebende abgeschwächte SARS-CoV-2-Mutante sCPD9 und die SARS-CoV-2-Varianten B.1 (BetaCoV/München/ChVir984/2020; B.1, EPI_ISL_406862), Beta (B.1.351; hCoV-19/Niederlande/ NoordHolland_20159/2021) und Delta (B.1.617.2; SARS-CoV-2, Mensch, 2021, Deutschland ex Indien, 20A/452R (B.1.617)) wurden auf Vero E6-TMPRSS2-Zellen vermehrt. Omicron BA.1 (B.1.1.529.1; hCoV-19/Deutschland/BE-ChVir26335/2021, EPI_ISL_7019047) wurde auf CaLu-3-Zellen vermehrt. Alle Virusbestände wurden vor Infektionsexperimenten einer Sequenzierung des gesamten Genoms unterzogen, um die genetische Integrität in der Mehrheit der Population, insbesondere an der Furin-Spaltungsstelle, zu bestätigen. Vor der experimentellen Infektion wurden die Virusvorräte bei –80 °C gelagert.

Neun bis 11 Wochen alte Syrische Hamster (Mesocricetus auratus; Rasse RjHan:AURA) wurden von Janvier Labs gekauft und in Gruppen von 2 bis 3 Tieren in individuell belüfteten Käfigen gehalten. Die Hamster hatten freien Zugang zu Futter und Wasser. Vor der Impfung durften sie sich 7 Tage lang an die Unterbringungsbedingungen gewöhnen. Bei beiden Experimenten wurden die Käfigtemperaturen in einem konstanten Bereich von 22 bis 24 °C und einer relativen Luftfeuchtigkeit zwischen 40 und 55 % gehalten.

Für Infektionsexperimente wurden syrische Hamster nach dem Zufallsprinzip in Gruppen eingeteilt, wobei 50–60 % der Tiere in jeder Gruppe weiblich waren. Im ersten Experiment wurden 15 Hamster scheingeimpft oder mit lebend abgeschwächtem sCPD9-Virus, Ad2-Spike oder mRNA geimpft. Die Impfung mit sCPD9 erfolgte durch intranasale Instillation unter Narkose (1 × 105 fokusbildende Einheiten (ffu), 60 µl)53. Ad2-Spike (5 × 108 infektiöse Einheiten, 200 μl) und mRNA-Impfstoff (5 μg mRNA, 100 μl) wurden intramuskulär verabreicht. Scheingeimpfte Hamster wurden durch intranasale Instillation mit sterilem Zellkulturüberstand geimpft, der aus nicht infizierten Vero E6-TMPRSS2-Zellen gewonnen wurde. 21 Tage nach der Impfung wurden Hamster durch intranasale Instillation unter Narkose mit der SARS-CoV-2-Delta-Variante (1 × 105 Plaque-bildende Einheiten (pfu), 60 µl) provokativ infiziert. Im zweiten Experiment wurden 10 Hamster entweder scheingeimpft oder mit einem der drei Impfstoffe (siehe oben) geimpft, gefolgt von einer Auffrischungsimpfung 21 Tage später. 14 Tage nach der Auffrischungsimpfung wurden die Hamster wie oben beschrieben geimpft.

Um die Weiterübertragung des Challenge-Virus bei geimpften Personen zu bestimmen, haben wir 3 Tiere pro Gruppe in einem Prime-Boost-Regime geimpft. Zu diesem Zweck erhielten Hamster entweder 1 × 104 ffu sCPD9delFCS in 60 µl MEM intranasal, 5 µg BNT162b2-mRNA in 100 µl normaler Kochsalzlösung (0,9 % NaCl in sterilem Wasser) intramuskulär oder 60 µl einfaches MEM intranasal (Schein). Die Impfung wurde 21 Tage nach der ersten Impfung mit den gleichen Impfstoffen für die jeweilige Gruppe verstärkt.

Geimpfte Hamster wurden wie oben beschrieben mit 1 × 105 pfu SARS-CoV-2 Variante B.1 provokant infiziert. 24 Stunden nach der Infektion wurden infizierte geimpfte Hamster mit naiven Tieren in Kontakt gebracht und sechs aufeinanderfolgende Tage lang zusammengelebt, um die Übertragung zu überwachen. Von jedem Tier wurden täglich Mundabstriche entnommen, um die Virusausscheidung und -übertragung zu überwachen.

sCPD9 wurde auf Vero E6-TMRSS2-Zellen gezüchtet und wie zuvor beschrieben auf Vero E6-Zellen titriert; Die endgültigen Titer wurden in MEM auf 2 × 106 ffu ml−1 eingestellt. Rekombinanter Ad2-Spike wurde erzeugt, auf 293T-Zellen produziert und wie zuvor beschrieben gereinigt23. BNT162b2 wurde als kommerzielles Produkt (Comirnaty) bezogen und genau wie vom Hersteller empfohlen gehandhabt, mit der Ausnahme, dass die Endkonzentration der mRNA auf 50 µg ml−1 (100 µg ml−1 ist die empfohlene Konzentration für die Verwendung beim Menschen) eingestellt wurde Zugabe von Kochsalzlösung in Injektionsqualität (0,9 % NaCl in sterilem Wasser) unmittelbar vor der Verwendung.

Um die genetische Stabilität des sCPD9-Konstrukts zu erhöhen, wurde die Furin-Spaltungsstelle (FCS) des Spike-Proteins gelöscht, um sCPD9delFCS zu erstellen. Dieses FCS-deletierte Impfvirus wurde nur für die Übertragungsstudie dieser Arbeit verwendet (Extended Data Abb. 5). Wichtig ist, dass alle in dieser Studie verwendeten Impfstoffe dasselbe SARS-CoV-2-Spike-Antigen enthalten, das von der angestammten B.1-Sequenz (Wuhan) abgeleitet ist.

sCPD9 wurde intranasal unter Vollnarkose (0,15 mg kg-1 Medetomidin, 2,0 mg kg-1 Midazolam und 2,5 mg kg-1 Butorphanol) in einer Dosis von 1 × 105 ffu pro Tier in einem Gesamtvolumen von 60 µl MEM verabreicht. Für Transmissionsexperimente (Extended Data Abb. 5) wurde 1 × 104 ffu sCPD9delFCS auf die gleiche Weise angewendet. Ad2-Spike wurde intramuskulär mit 5 × 108 infektiösen Einheiten in 200 µl Injektionspuffer (3 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 % Glycerin in PBS) injiziert. BNT162b2 wurde intramuskulär in einer Dosis von 5 µg mRNA pro Tier in 100 µl physiologischer Kochsalzlösung (0,9 % NaCl in sterilem Wasser) injiziert.

In dieser Studie wurden von jedem Hamster Nasenspülungen durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde der Schädel jedes Tieres leicht paramedian gespalten, sodass die Nasenscheidewand auf einer Seite der Nase intakt blieb. Anschließend wurde eine 200 µl Pipettenspitze vorsichtig unter die Nasenscheidewand geschoben und 150 µl Waschflüssigkeit (PBS mit 30 µg ml−1 Ofloxacin und 10 µg ml−1 Voriconazol) aufgetragen. Die Flüssigkeit wurde durch das Nasenloch gesammelt und der Waschvorgang wurde zweimal wiederholt; Nach dem dritten Waschvorgang wurden etwa 100 µl Probe gewonnen.

Nasenspülungen, die aus der Erstimpfungsstudie gewonnen wurden, wurden einer ELISA-Analyse (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) auf SARS-CoV-2-Spike-spezifische IgA-Antikörper unterzogen. Nasenspülungen aus dem Prime-Boost-Impfversuch wurden für einen Mikroneutralisationstest verwendet, um ihre Fähigkeit zur Neutralisierung der SARS-CoV-2-Vorfahrenvariante B1 zu bewerten.

Zur Quantifizierung des replikationskompetenten Virus wurden 50 mg Lungengewebe verwendet. Nach der Homogenisierung der Organproben in einer Perlmühle (Analytic Jena) wurden serielle 10-fache Verdünnungen hergestellt. Die Verdünnungen wurden auf Vero E6-Zellen ausplattiert, die in Platten mit 24 Vertiefungen gezüchtet wurden, und 2,5 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit MEM mit 1,5 % Carboxymethylcellulose-Natrium (Sigma Aldrich) überschichtet und 72 Stunden nach der Infektion mit 4 % Formaldehydlösung fixiert. Um die Plaque-bildenden Einheiten zu zählen, wurden die Platten mit 0,75 % Methylenblau gefärbt.

Die Lungen wurden wie zuvor beschrieben verarbeitet53. Nach sorgfältiger Entfernung des linken Lungenlappens wurde das Gewebe 48 Stunden lang in PBS-gepufferter 4%iger Formaldehydlösung (pH 7,0) fixiert. Zur Conchae-Präparation wurden Teile der linken Schädelhälfte entsprechend fixiert. Anschließend wurden Lungen oder Muscheln vorsichtig aus der Nasenhöhle entfernt und in Paraffin eingebettet, in 2 µm Dicke geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt. Die In-situ-Hybridisierung an der Lunge wurde wie zuvor beschrieben54 unter Verwendung des ViewRNA ISH Tissue Assay Kit (Invitrogen von Thermo Fisher) gemäß den Anweisungen des Herstellers mit geringfügigen Anpassungen durchgeführt. Für die SARS-CoV-2-RNA-Lokalisierung wurden Sonden zum Nachweis von N-Gensequenzen (NCBI-Datenbank NC_045512.2, Nukleotide 28.274–29.533, Assay-ID: VPNKRHM) verwendet. Die sequenzspezifische Bindung wurde mithilfe einer Sonde zum Nachweis von Pneumolysin kontrolliert. Die Immunhistochemie an Conchae wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Einzelheiten unter „Ergänzende Methoden“).

Die verblindete mikroskopische Analyse wurde von einem staatlich geprüften Veterinärpathologen (JB) durchgeführt.

Ein interner ELISA wurde durchgeführt, um die SARS-spezifischen IgG-Spiegel im Serum und die SARS-spezifischen IgA-Spiegel in Nasenspülungen nach der Impfung zu untersuchen (Einzelheiten unter „Ergänzende Methoden“).

Um die Fähigkeit von Nasenspülungen aus dem Prime-Boost-Impfversuch zur Neutralisierung von authentischem SARS-CoV-2 (B.1) zu beurteilen, wurden Nasenspülungen 1:1 in 2× MEM verdünnt, das 50 µg ml−1 Enrofloxacin und 10 µg enthielt ml−1 Voriconazol. Nachfolgende Verdünnungsreihen wurden in MEM mit 25 mg ml-1 Enrofloxacin, 5 µg ml-1 Voriconazol und 1 % FBS durchgeführt. SARS-CoV-2 (50 pfu) wurde zu den Nasenspülverdünnungen hinzugefügt und Verdünnungen von 1:2 bis 1:256 auf nahezu konfluente Vero E6-Zellen ausplattiert, die in Zellkulturplatten mit 96 Vertiefungen ausgesät wurden. 3 Tage nach der Inokulation wurden die Zellen fixiert und mit Methylenblau angefärbt. Um virusneutralisierende Verdünnungen zu identifizieren, wurde die Integrität der Zellmonoschicht durch Vergleich mit Kontrollvertiefungen beurteilt, die entweder keine Nasenspülung oder kein Virus enthielten. Die letzte Verdünnung ohne Anzeichen einer virusinduzierten zytopathischen Wirkung wurde als neutralisierender Titer für die jeweilige Probe angesehen.

Serumproben wurden auf ihre Fähigkeit getestet, verschiedene SARS-CoV-2-Varianten zu neutralisieren. Proben vom Tag 0 des Prime-Boost-Versuchs konnten aufgrund von Materialmangel nicht auf neutralisierende Antikörper gegen B.1.351 (Beta) getestet werden. Die Seren wurden 30 Minuten lang bei 56 °C inaktiviert. Zweifache Reihenverdünnungen (1:8 bis 1:1.024) wurden auf Platten mit 96 Vertiefungen ausplattiert und 200 pfu SARS-CoV-2 in jede Vertiefung pipettiert. Nach einer Inkubationszeit von 1 Stunde bei 37 °C wurden die Verdünnungen auf 96-Well-Platten mit subkonfluenten Vero E6-Zellen übertragen und 72 Stunden lang bei 37 °C (B.1, Beta, Delta) oder 96 Stunden lang inkubiert bei 37 °C (Omicron). Die Platten wurden mit 4 %iger Formaldehydlösung fixiert und mit 0,75 % Methylenblau gefärbt. Vertiefungen, die keine zytopathische Wirkung zeigten, galten als neutralisiert.

Die Hamster-IFN-γ-ELISpot-Analyse wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt56. Kurz gesagt, das Hamster-IFN-γ-ELISpotBASIC-Kit (MABTECH) wurde zum Nachweis der IFN-γ-Sekretion durch 5 × 105 isolierte Splenozyten verwendet, jeweils in Co-Kultur mit unterschiedlichen Stimuli. Mit Medium behandelte Splenozyten dienten als Negativkontrolle und rekombinantes Ovalbumin (10 mg ml−1) wurde als negativer Proteinkontrollstimulus verwendet. Eine allgemeine Stimulation der T-Zellen wurde mit 5 μg ml–1 Concanavalin A (ConA, Sigma Aldrich) erreicht. Rekombinantes SARS-CoV-2 (2019-nCoV)-Spike-Protein (S1 + S2 ECD, His-Tag; 10 mg ml-1; Sino Biological Europe) oder 10 mg ml-1 rekombinantes SARS-CoV-2 (2019-nCoV)-Nukleokapsid Protein (N) (Sino Biological Europe) wurden verwendet, um SARS-CoV-2-spezifische T-Zellen erneut zu stimulieren. Die Spots wurden mit einem Eli.Scan ELISpot-Scanner (AE.L.VIS) und der Analysesoftware ELI.Analyse v5.0 (AE.L.VIS) gezählt.

Um genomische Kopien in oropharyngealen Abstrichen und 25 mg homogenisiertem Lungengewebe zu quantifizieren, wurde RNA mit dem innuPREP Virus DNA/RNA Kit (Analytic Jena) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. qPCR wurde unter Verwendung des NEB Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR-Kits (New England Biolabs) mit Zyklusbedingungen von 10 Minuten bei 55 °C für die reverse Transkription, 3 Minuten bei 94 °C für die Aktivierung des Enzyms und 40 Zyklen durchgeführt von 15 s bei 94 °C und 30 s bei 58 °C auf einem qTower G3 Cycler (Analytic Jena) in versiegelten qPCR 96-Well-Platten. Primer und Sonden wurden wie zuvor berichtet57 verwendet. Oligonukleotide (Sequenz (5'-3')): E_Sarbeco_F: ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT;

E_Sarbeco_R: ATATTGCAGCAGTACGCACACA;

E_Sarbeco_P1: FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BBQ.

Zur Quantifizierung der Genexpression verwendeten wir die MesAur 2.0-Genomassemblierung und -Annotation, die über die NCBI-Genomdatenbank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/11998?genome_assembly_id=1585474) verfügbar ist. Die GFF-Datei wurde mit gffread 0.12.758 in GTF konvertiert. Wo keine Überlappungen entstanden, wurden die 3'-UTRs in der Annotation wie zuvor beschrieben um 1.000 bp verlängert59. Weitere Polierschritte für die GTF-Datei werden auf der GitHub-Seite zu diesem Dokument beschrieben (https://github.com/Berlin-Hamster-Single-Cell-Consortium/Live-attenuated-vaccine-strategy-confers-superior-mucosal-and). -systemische-Immunität-gegen-SARS-CoV-2). Die endgültige GTF-Datei, die für die Analyse verwendet wurde, ist über GEO verfügbar (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE200596).

Zur Durchführung der RNA-Massensequenzierung wurde RNA aus Lungengewebe unter Verwendung von Trizol-Reagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers (Ambion, Life Technologies) isoliert. Kurz gesagt, 1 ml Trizol wurde zu der homogenisierten Organprobe gegeben und gründlich verwirbelt. Nach einer Inkubationszeit von 20 min wurden 200 µl Chloroform zugegeben. Die Proben wurden erneut gevortext und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Röhrchen 15 Minuten lang bei 4 °C und 12.000 × g zentrifugiert und 500 µl der wässrigen Phase in ein neues Röhrchen mit 10 µg GlycoBlue überführt. Isopropanol (500 µl) wurde zugegeben, gefolgt vom Vortexen, Inkubieren und Zentrifugieren der Proben wie oben beschrieben. Danach wurde Isopropanol entfernt und 1 ml Ethanol (75 %) aufgetragen. Die Röhrchen wurden kurz umgedreht und 10 Minuten lang bei 8.000 × g zentrifugiert. Nachdem das Pellet vom Ethanol befreit worden war, wurde die RNA in 30 µl RNase-freiem Wasser resuspendiert und bei –80 °C gelagert.

Weiße Blutkörperchen wurden wie zuvor beschrieben aus EDTA-Blut isoliert; Zu den Schritten gehörten die Lyse roter Blutkörperchen und die Zellfiltration vor der Zählung. Lungenzellen (Schwanzlappen) wurden wie zuvor beschrieben isoliert26,60; Zu den Schritten gehörten enzymatischer Aufschluss, mechanische Dissoziation und Filtration vor der Zählung in Trypanblau. Puffer enthielten 2 µg ml-1 Actinomycin D, um die De-novo-Transkription während der Verfahren zu verhindern.

Um Einzelzellsuspensionen aus der Nasenschleimhaut von SARS-CoV-2-infizierten Hamstern zu gewinnen, wurde der Schädel jedes Tieres leicht paramedian gespalten, sodass die Nasenscheidewand auf der linken Seite der Nase intakt blieb. Die rechte Seite der Nase wurde vorsichtig vom Schädel entfernt und bis zur weiteren Verwendung in eiskaltem 1× PBS mit 1 % BSA und 2 µg ml−1 Actinomycin D gelagert. Nasenteile wurden in 5 ml Corning Dispase-Lösung, ergänzt mit 750 U ml-1 Collagenase CLS II und 1 mg ml-1 DNase, überführt und 15 Minuten bei 37 °C inkubiert. Zur Präparation von Zellen aus der Nasenschleimhaut wurden die Muscheln vorsichtig aus der Nasenhöhle entfernt und erneut für 20 Minuten bei 37 °C in Verdauungsmedium inkubiert. Conchae-Gewebe wurde durch Pipettieren und Pressen durch einen 70-µm-Filter mit einem Kolben dissoziiert. Um die enzymatische Verdauung zu stoppen, wurde eiskaltes PBS mit 1 % BSA und 2 µg ml-1 Actinomycin D zugegeben. Die Zellsuspension wurde 15 Minuten lang bei 4 ° C und 400 × g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Die pelletierten Nasenzellen wurden in 5 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen resuspendiert und 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lysereaktion wurde mit 1 × PBS mit 0,04 % BSA gestoppt und die Zellen 10 Minuten lang bei 400 × g und 4 °C zentrifugiert. Pelletierte Zellen wurden in 1× PBS mit 0,04 % BSA resuspendiert und 40 µm filtriert. Lebende Zellen wurden in Trypanblau gezählt und die Lebensfähigkeitsraten mithilfe einer Zählkammer bestimmt. Die Zellkonzentration für scRNA-seq wurde durch Verdünnung angepasst.

Isolierte Zellen aus Blut, Lunge und Nasenhöhlen syrischer Hamster wurden einer scRNA-Seq unter Verwendung des 10× Genomics Chromium Single Cell 3' Gene Expression System mit Feature-Barcoding-Technologie für Zellmultiplexing unterzogen (Einzelheiten in den ergänzenden Methoden).

Sequenzierungslesevorgänge wurden zunächst mit bcl2fastq 2.20.0 und dem Multi-Befehl der Cell Ranger 6.0.2-Software verarbeitet. Für das Cellplex-Demultiplexing wurden die Zuweisungsschwellenwerte teilweise angepasst (Details finden Sie auf der GitHub-Seite unter https://github.com/Berlin-Hamster-Single-Cell-Consortium/Live-attenuated-vaccine-strategy-confers-superior- Schleimhaut-und-systemische-Immunität-gegen-SARS-CoV-2). Die weitere Verarbeitung erfolgte in R 4.0.4 Seurat R 4.0.6 package61 sowie in den R-Paketen ggplot2 3.3.5, dplyr 1.0.7, DESeq2 1.30.1, lme4 1.1–27.1 und Abhängigkeiten sowie in Python 3.9.13 as sowie Python-Pakete scanpy 1.9.1, scvelo 0.2.4 und Abhängigkeiten. Im nächsten Schritt wurden die Zellen nach einem losen Qualitätsschwellenwert (mindestens 250 erkannte Gene pro Zelle) gefiltert und geclustert. Anschließend wurden die Zelltypen pro Cluster mit Anmerkungen versehen und mithilfe zelltypspezifischer Schwellenwerte gefiltert (Zellen unterhalb des Medians oder im untersten Quartil innerhalb eines Zelltyps wurden entfernt). Die verbleibenden Zellen wurden mit dem SCT/Integrate-Workflow62 verarbeitet und die Zelltypen wurden erneut mit Anmerkungen zum resultierenden Seurat-Objekt versehen. Der gesamte Code für die Downstream-Analyse ist auf GitHub unter https://github.com/Berlin-Hamster-Single-Cell-Consortium/Live-attenuated-vaccine-strategy-confers-superior-mucosal-and-systemic-immunity-to- verfügbar. SARS-CoV-2.

Einzelheiten zur statistischen Analyse von Sequenzierungsdaten einschließlich Vorverarbeitungsschritten werden im Abschnitt zu den einzelnen Methoden beschrieben. Analysen der virologischen, histopathologischen, ELISA-, Zellhäufigkeits- und Zellzahlstatistiken wurden mit GraphPad Prism 9 durchgeführt. Statistische Details sind in den jeweiligen Abbildungslegenden angegeben. Zur Bestimmung der Stichprobengröße wurde keine statistische Methode verwendet. Es wurde angenommen, dass die Datenverteilung normal sei, dies wurde jedoch nicht offiziell getestet. Es wurden keine Daten von den Analysen ausgeschlossen. Alle Experimente mit lebenden Tieren waren randomisiert, andere Experimente waren nicht randomisiert. Die Forscher waren hinsichtlich der Zuordnung der Hamster während der Tierversuche und der primären Ergebnisbewertung (klinische Entwicklung, Virustitrationen, qPCR, ELISpot, Serologie und Histopathologie) blind. Die Forscher waren hinsichtlich der Zuordnung in anderen Experimenten und Analysen nicht blind.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Rohe Sequenzierungsdaten sind auf GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE200596) verfügbar, zusammen mit Bulk-RNA-seq-Read-Count-Tabellen sowie h5-Matrizen und Seurat Objekte für die scRNA-seq-Daten. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Der Code ist auf GitHub unter https://github.com/Berlin-Hamster-Single-Cell-Consortium/Live-attenuated-vaccine-strategy-confers-superior-mucosal-and-systemic-immunity-to-SARS-CoV verfügbar. 2.

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Referenzen herunterladen

Wir danken VM Corman von der Charité für die Hilfe beim Studiendesign und die produktiven Diskussionen über Ergebnisse und Schlussfolgerungen; S. Reiche (Friedrich-Loeffler-Institut, Greifswald, Deutschland) für die Bereitstellung von Anti-SARS-CoV-2-Nukleokapsid-Antikörpern; C. Thöne-Reineke für Unterstützung im Tierschutz und in der Tierhaltung; und das Europäische Virusarchiv, D. Bourquain (Robert-Koch-Institut, Berlin, Deutschland) und C. Reusken (Nationales Institut für öffentliche Gesundheit und Umwelt, Bilthoven, Niederlande) für die Bereitstellung der in dieser Studie verwendeten SARS-CoV-2-Varianten . Vero E6-TMPRSS2-Zellen wurden vom NIBSC Research Reagent Repository, Großbritannien, mit Dank an M. Takeda zur Verfügung gestellt. Die Finanzierung erfolgte durch: das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union – EVA-GLOBAL-Zuschuss 871029; Deutsche Forschungsgemeinschaft-Stipendium OS 143/16-1 (NEIN); Deutsche Forschungsgemeinschaft Förderung SFB TR84, Teilprojekt Z01b (JT, ADG); Deutsche Forschungsgemeinschaft fördert SFB TR84, Teilprojekte C06 und C09 (MW); Förderung der Deutschen Forschungsgemeinschaft SFB 1449–431232613, Teilprojekt B02 (MW, GN); Bundesministerium für Bildung und Forschung – MAPVAP-Stipendium 16GW0247 (GN, MW); Bundesministerium für Bildung und Forschung – Organo-Strat-Stipendium 01KX2021 (ADG); Bundesministerium für Bildung und Forschung – e:Med CAPSyS-Stipendium 01ZX1604B (MW); Bundesministerium für Bildung und Forschung – e:Med SYMPATH-Stipendium 01ZX1906A (MW); Bundesministerium für Gesundheit – CHARIS 6a-Stipendium (MDM); Einstein Foundation 3R-Stipendium EZ-2020-597 FU (ADG); Impuls- und Vernetzungsfonds der Helmholtz-Gemeinschaft – COVIPA-Stipendium KA1-Co-02 (GTA, ML, EW); und ein Charité 3R-Stipendium (PP, CG). Die Geldgeber hatten keinen Einfluss auf das Studiendesign, die Datenerfassung und -analyse, die Entscheidung zur Veröffentlichung oder die Erstellung des Manuskripts.

Open access funding provided by Freie Universität Berlin.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Geraldine Nouailles, Julia M. Adler.

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Emanuel Wyler, Dusan Kunec, Jakob Trimpert.

Department of Infectious Diseases, Respiratory Medicine and Critical Care, Charité – Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, Berlin, Germany

Geraldine Nouailles, Julia M. Adler, Peter Pennitz, Morris Baumgardt, Cengiz Goekeri & Martin Witzenrath

Institut für Virologie, Freie Universität Berlin, Berlin, Germany

Julia M. Adler, Christine Langner, Ricardo Martin Vidal, Na Xing, Azza Abdelgawad, Nikolaus Osterrieder, Dusan Kunec & Jakob Trimpert

Institute of Pathology Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, and Institute for Biology, IRI Life Sciences, Humboldt-Universität zu Berlin, Berlin, Germany

Stefan Peidli & Nils Blüthgen

Berliner Institut für Medizinische Systembiologie (BIMSB), Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in der Helmholtz-Gemeinschaft (MDC), Berlin, Deutschland

Luiz Gustavo Teixeira Alves und Emanuel Wyler

Institut für Tierpathologie, Freie Universität Berlin, Berlin, Germany

Judith Bushe, Anne Voss, Alina Langenhagen & Achim D. Gruber

Institute of Virology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, Berlin, Germany

Fabian Pott, Julia Kazmierski, Daniela Niemeyer, Christian Drosten & Christine Goffinet

Berlin Institute of Health (BIH), Berlin, Deutschland

Fabian Pott, Julia Kazmierski & Christine Goffinet

Produktprüfung von IVMPs, Abteilung Veterinärmedizin, Paul-Ehrlich-Institut, Langen, Deutschland

Aileen Ebenig, Mona V. Lange & Michael D. Mühlebach

German Center for Infection Research (DZIF), partner site Gießen-Marburg-Langen, Giessen, Germany

Michael D. Mühlebach

Medizinische Fakultät, Cyprus International University, Nikosia, Zypern

Dschingis Goekeri

Institute of Physiology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, Berlin, Germany

Szandor Simmons

Department of Gynecology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, Berlin, Germany

Susanne Herwig & Günter Cichon

Deutsches Zentrum für Infektionsforschung (DZIF), Partnerstandort Charité, Berlin, Deutschland

Daniela Niemeyer & Christian Drosten

Berliner Institut für Medizinische Systembiologie (BIMSB), Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in der Helmholtz-Gemeinschaft (MDC) und Institut für Biologie, Humboldt-Universität zu Berlin, Berlin, Deutschland

Markus Landthaler

Fakultät für Biowissenschaften, Universität Chongqing, Chongqing, China

Haibo Wu

Berlin Institute of Health at Charité, Universitätsmedizin Berlin, Berlin, Germany

Samantha D. Praktiknjo

Abteilung für Infektionskrankheiten und öffentliche Gesundheit, Jockey Club College für Veterinärmedizin und Biowissenschaften, City University of Hong Kong, Kowloon, Hongkong, China

Nikolaus Osterrieder

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DK und JT konzipierten das Projekt. GN, JMA, PP, SP, GTA, MB, JB, AV, AL, FP, JK, C. Goekeri, DN, HW, SDP, EW, DK und JT haben die Methodik entwickelt. GN, JMA, PP, SP, GTA, JB, AV, AL, AE, MVL, MDM, SS, NX, CL, RMV, AA, SH, HW, ADG, SDP, EW, DK und JT führten die Untersuchungen durch. GN, JMA, PP, SP, GTA, JB, AV, AL, SDP, EW, DK und JT führten eine Visualisierung durch. GN, GC, ADG, C. Goffinet, MW, DN, CD und JT haben Ressourcen erworben. NO und JT haben Fördermittel eingeworben. JT verwaltete das Projekt. GN, GC, CD, C. Goffinet, ML, NB, MW, ADG, SDP, NO, DK, EW und JT betreuten das Projekt. GN, JMA, EW, DK und JT haben den Originalentwurf geschrieben. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft und bearbeitet.

Korrespondenz mit Jakob Trimpert.

Im Zusammenhang mit dieser Arbeit hat die Freie Universität Berlin einen Patentantrag (FU227EP - 22193939.0- 1111, Freie Universität Berlin, Deutschland) für die Verwendung von sCPD9 als Impfstoff beim Menschen eingereicht. In dieser Anmeldung werden JT, NO und DK als Erfinder von sCPD9 genannt. Die Freie Universität Berlin kooperiert mit RocketVax Inc. zur Weiterentwicklung von sCPD9 und erhält Fördermittel für die Forschung. Unabhängig von dieser Arbeit hat GN eine Projektförderung von der Biotest AG erhalten; und MW erhielten Forschungsförderung von Bayer Health Care, Biotest, Pantherna und Vaxxilon sowie für Vorträge und Beratung von Alexion, Aptarion, Astra Zeneca, Bayer Health Care, Berlin Chemie, Biotest, Boehringer Ingelheim, Chiesi, Glaxo Smith Kline, Insmed, Novartis, Teva und Vaxxilon. Die anderen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Microbiology dankt Duane Wesemann und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

(a) Die prozentuale Entwicklung des Körpergewichts der erstgeimpften Hamster wurde 21 Tage lang bis zum Zeitpunkt der Virusexposition gemessen und je nach Impfgruppe angezeigt. Violine-Plot (abgeschnitten) mit Quartilen und Median. (b) Prime-Boost-Experiment: Relative Expression der gesamten kanonischen Verbindungs-übergreifenden viralen mRNA-Transkripte von SARS-CoV-2 im Vergleich zu den gesamten genomischen Transkripten, die nach einer Analyse der Massen-RNA-Sequenzierung aus homogenisiertem Lungengewebe generiert wurden. Die Werte werden für beide analysierten Zeitpunkte im log10-Maßstab angezeigt. Streupunktdiagramm mit Mittelwert. Zweifaktorielle ANOVA (Varianzanalyse) und Tukey-Mehrfachvergleichstest. (c – j) Semiquantitative Bewertung der histopathologischen Befunde syrischer Hamster im Prime- (c – f) und Prime-Boost-Modus (g – j): (c, g) Der im linken Lungenlappen gefundene konsolidierte Lungenbereich wird angezeigt in Prozent. (d, h) Der Bronchitis-Score berücksichtigt den Schweregrad der Bronchialepithelnekrose und Bronchitis. (e, i) Um die lokale zelluläre Immunantwort zu berücksichtigen, wurde die pulmonale Infiltration von Neutrophilen, Lymphozyten und Makrophagen im Leukozyten-Influx-Score bewertet. (f, j) Das Ausmaß der Endothelialitis im linken Lungenlappen wird im Endothelialitis-Score angezeigt. (c – j) Die Ergebnisse werden als Mittel- (Median), Box- (25. bis 75. Perzentil) und Whisker-Diagramme (Min. bis Max.) angezeigt. Zweifaktorielle ANOVA und Tukey-Mehrfachvergleichstest. ∗p < 0,05, ∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001 und ∗∗∗∗p < 0,0001. (b – j) n = 5 einzelne Hamster für alle Gruppen. Prime- und Prime-Boost-Experimente wurden unabhängig voneinander durchgeführt.

Quelldaten

Repräsentative Histopathologie von Hämatoxylin- und Eosin-gefärbten Lungenschnitten aus Prime-only- und Prime-Boost-Impfexperimenten bei 5 dpc. Die Bilder sind repräsentativ für n = 5 Hamster pro angegebener Gruppe. Prime- und Prime-Boost-Experimente wurden unabhängig voneinander durchgeführt. Für beide Experimente zeigen die Spalten von links nach rechts Bronchitis, Lungenentzündung der Atemwegsalveolen und Blutgefäße mit Endothelialitis. Im Prime-Only-Ansatz und im Gegensatz zu allen anderen Gruppen, die eine nekrosupperative und hyperplastische Bronchitis entwickelten, hatten nur mit sCPD9 geimpfte Hamster eine vernachlässigbare Bronchitis bei Vorliegen einer BALT-ähnlichen subepithelialen Infiltration mit Lymphozyten und Plasmazellen. In der Lunge wiesen die Alveolen von mit sCPD9 geimpften Tieren ein viel weniger konsolidiertes respiratorisches Parenchym mit weniger infiltrierenden Makrophagen und Neutrophilen auf. Nur Ad2- und scheingeimpfte Tiere entwickelten eine ausgeprägte alveoläre metaplastische Remodellierung, was auf eine Regeneration nach Nekrose des Alveolarepithels hinweist. Die Endothelialitis war in allen geimpften Gruppen milder als bei scheingeimpften Tieren. In den Prime-Boost-Experimenten war die hyperplastische Bronchitis bei mit sCPD9+sCPD9 und mRNA+sCPD9 geimpften Hamstern am mildesten. Die Konsolidierung des Atemwegsparenchyms und die Alveolitis waren in beiden mit sCPD9 geboosterten Gruppen am wenigsten schwerwiegend. Der metaplastische epitheliale Umbau war bei mit Ad2-Ad2 geimpften Tieren besonders ausgeprägt. Die Endothelialitis wurde in allen geboosterten Gruppen stark und in ähnlichem Ausmaß reduziert. Maßstabsbalken = 20 μm für jede Spalte.

Quelldaten

(a) Zweidimensionale Projektionen von Einzelzelltranskriptomen unter Verwendung von UMAP von Blutzellen aus dem Prime-Boost-Experiment. Zellen werden nach Zelltypen gefärbt, die auf der Grundlage bekannter Markergene annotiert sind. (b, d) Anzahl der Zellbestandteile pro ml Blut für das Prime-Boost-Experiment. (c) Prozentsatz der Blutzellbestandteile für das Prime-Boost-Experiment. (b – d) Gezeigt werden die einfaktorielle ANOVA und der Mehrfachvergleichstest von Dunnett mit einer Mock-Mock-Gruppe pro Zelltyp. Mittelwert ± SEM, Symbole repräsentieren einzelne Hamster. nsCPD9 + sCPD9 = 3, nmRNA + sCPD9 = 3, nmRNA + mRNA = 3, nAd2 + Ad2 = 3, nmock + Mock = 4 einzelne Hamster als Symbole. ∗p < 0,05, ∗∗p < 0,01 und ∗∗∗p < 0,001.

Quelldaten

(a) Semiquantitative Auswertung histopathologischer Befunde bei Hamstern, die eine Erstimpfung (obere Reihe) oder eine Auffrischimpfung (untere Reihe) erhielten. Die Fläche, die durch eine SARS-CoV-2-Infektion von Schleimhautschäden betroffen ist, wird in Prozent angegeben. Der Gewebeschadensscore berücksichtigt Epithelablösung, Nekrose, Apoptose, Zelltrümmer und Zilienverlust. Das Vorhandensein von Neutrophilen und Lymphozyten in den Nasenmuscheln wird anhand des Immunzell-Scores beurteilt. Mitte (Median), Box (25. bis 75. Perzentil) und Whiskers (Min. bis Max.). Zur statistischen Auswertung wurden eine Zwei-Wege-ANOVA und ein Tukey-Mehrfachvergleichstest durchgeführt. N = 5 einzelne Hamster pro Gruppe. ∗p < 0,05, ∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001, ∗∗∗∗p < 0,0001. (b) Zweidimensionale Projektionen von Einzelzelltranskriptomen unter Verwendung von UMAP von Nasengewebezellen aus dem Primärexperiment. Die Färbung zeigt Zelltypen an, die auf der Grundlage bekannter Markergene annotiert sind.

Quelldaten

(a) Entwurf eines Proof-of-Principle-Weiterleitungsexperiments. Hamster wurden mit einem an der Furin-Spaltungsstelle deletierten sCPD9 LAV oder dem mRNA-Impfstoff BNT162b2 in einem Prime-Boost-Schema geimpft. Die Provokationsinfektion wurde mit der SARS-CoV-2-Variante B.1 durchgeführt. Geimpfte und provozierte Tiere wurden 24 Stunden nach der Provokation an 6 aufeinanderfolgenden Tagen zusammen mit naiven Kontaktpersonen gehalten. (b) SARS-CoV-2-RNA-Belastung in täglichen Mundabstrichen, die geimpften Ausscheidern während der gesamten Zeit der gemeinsamen Unterbringung entnommen wurden. N = 3 pro Gruppe, Mittelwert ± SEM. Zweifaktorielle ANOVA, Tukeys Mehrfachvergleichstest. (c) SARS-CoV-2-RNA-Belastung in der Lunge und (d) Rachenabstriche bei der Beendigung geimpfter Tiere. N = 3, Mittelwert ± SEM, einfache ANOVA, Tukey-Mehrfachvergleichstest. (e) SARS-CoV-2-RNA-Belastung in täglichen Mundabstrichen, die von unbehandelten Kontakttieren während der gesamten Zeit der gemeinsamen Unterbringung entnommen wurden. N = 3, Mittelwert ± SEM. Zweifaktorielle ANOVA, Tukeys Mehrfachvergleichstest. (f) SARS-CoV-2-RNA-Belastung in der Lunge und (G) Rachenabstriche bei der Beendigung naiver Kontakttiere. N = 3, Mittelwert ± SEM, einfache ANOVA, Tukey-Mehrfachvergleichstest. ∗p < 0,05, ∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001, ∗∗∗∗p < 0,0001. Panel a wurde mit BioRender.com erstellt.

Quelldaten

Ergänzende Abbildungen. 1–13, Methoden und Referenzen.

Statistische Quelldaten für ergänzende Abbildungen.

Statistische Quelldaten.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Nouailles, G., Adler, JM, Pennitz, P. et al. Der abgeschwächte Lebendimpfstoff sCPD9 löst bei Hamstern eine überlegene mukosale und systemische Immunität gegen SARS-CoV-2-Varianten aus. Nat Microbiol 8, 860–874 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01352-8

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Eingegangen: 30. Juni 2022

Angenommen: 01. März 2023

Veröffentlicht: 3. April 2023

Ausgabedatum: Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01352-8

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